Молекулярно-генетический анализ факторов риска коронаросклероза и ишемической болезни мозга 03. 00. 26 Молекулярная генетика

Представлены сведения о предстоящей защите диссертации
ТУПИЦЫНА ТАТЬЯНА ВИКТОРОВНА

«Молекулярно-генетический анализ факторов риска коронаросклероза и ишемической болезни мозга» 03.00.26 – молекулярная генетика

биологические науки

Д 001.016.01

ГУ Медико-генетический научный центр РАМН

115478, Москва, ул. Москворечье, д.1

Тел.111-85-80

E-mail: genreprlab@mtu-net.ru
Предполагаемая дата защиты диссертации – 14 мая 2007 года
_____________________________________________________________

На правах рукописи
ТУПИЦЫНА ТАТЬЯНА ВИКТОРОВНА

Молекулярно-генетический анализ факторов риска коронаросклероза и ишемической болезни мозга

03.00.26 – Молекулярная генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва, 2007 г.

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН

Научный руководитель: д.б.н. Сломинский П.А.
Официальные оппоненты: д.б.н. Карпухин А.В.

д.м.н. Метельская В.А.

Ведущая организация:

ФГУ Российский НИИ геронтологии Федерального агентства

по здравоохранению и социальному развитию

Защита диссертации состоится «___»____________ 2007 г. в ____ часов на заседании Диссертационного совета Д.001.016.01 в ГУ Медико-генетический научный цент РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Медико-генетического научного центра РАМН.

Автореферат разослан «___»____________ 2007 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета д.б.н. проф. Курило Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность проблемы.

Достижения современной молекулярной генетики по расшифровке генома человека способствовали рождению новой науки – медицинской геномики, одно из центральных мест в которой занимают исследования по изучению влияния генетических факторов на формирование патологических состояний человека. Особое место в данных исследованиях занимают заболевания сердечно-сосудистой системы (ССЗ), так как они широко распространены, характеризуются тяжелым течением, приводящим к инвалидизации, и высоким уровнем смертности Оганов Р.Г., 2002. Большое внимание уделяют таким заболеваниям, как ишемическая болезнь сердца (ИБС) и ишемическая болезнь мозга (ИБМ). В структуре смертности от ССЗ на долю этих заболеваний приходится около 85-90% Оганов Р.Г., 2002. Социальную значимость проблемы усиливает наблюдающаяся в последние годы тенденция к возникновению инсультов и инфарктов у лиц молодого возраста. В связи с этим исследования, посвященные изучению данных заболеваний, приобретают особую актуальность.

В основе развития ИБС и ИБМ лежит взаимодействие различных генетических факторов с факторами внешней среды. Сложность патогенеза создает большие трудности при изучении природы этих заболеваний. В связи с этим проблема исследования генетических механизмов ССЗ является достаточно сложной и связана с разработкой адекватных подходов и методов анализа, что отмечается многими авторами Huang S.,2000; Todd J.A.,1999. Один из эффективных подходов к изучению роли генетических механизмов развития ССЗ связан с выделением группы генов с потенциально наибольшим вкладом в патогенез заболевания – это так называемые гены-кандидаты.

Одним из основных пусковых механизмов патогенеза ИБС и ИБМ является нарушение функциональных свойств эндотелия, что в дальнейшем приводит к изменению тонуса сосудистой стенки и дальнейшему развитию и прогрессированию патологического процесса. В связи с этим большой интерес представляют гены, продукты которых участвуют в регуляции сосудистого тонуса.

Другой хорошо известный механизм развития ССЗ связан с нарушением липидного обмена [Dawber T.R., 1980; Shaper A.G., 1985]. Недавно были найдены новые белки, участвующие в обмене липидов [Dean M. et al., 2001; Van der Vliet H.N. et al., 2001]. Изменение их структуры и функций может быть фактором риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, в связи с чем, гены этих белков могут рассматриваться в качестве генов-кандидатов ИБС и ИБМ.

В последние годы в качестве потенциального патогенетического фактора при различных ССЗ рассматривается также апоптоз [Isner J.M. et al., 1995]. Известно, что апоптоз является одним из механизмов ишемического повреждения клетки и, возможно, основным фактором увеличения зоны инфаркта мозга при инсульте. В связи с этим, особую актуальность приобретают исследования, направленные на изучение генов, продукты которых вовлечены в реализацию программы клеточной гибели, что позволит в дальнейшем раскрыть молекулярно-генетические основы ишемического повреждения мозга и выявить факторы индивидуальной чувствительности вещества мозга к ишемии.

Существует несколько подходов к изучению мультифакториальных заболеваний, в том числе ИБС и ИБМ. Наиболее широко используются методы ассоциативного анализа типа "случай-контроль". На современном этапе наиболее эффективным методом изучения ИБС и ИБМ является сибсовый анализ Spielman R.S., Ewens W.J., 1998. Сибсовый метод позволяет проводить анализ сцепления между геном и заболеванием, поиск ассоциаций для выявления возможных связей между анализируемым полиморфизмом гена и различными клиническими проявлениями заболевания, как в группе пробандов, так и в группе их сибсов, а также оценить риск развития того или иного заболевания у лиц с отягощенным семейным анамнезом.

В связи с тем, что работы по изучению молекулярно-генетических основ наследственной предрасположенности к ИБС и ИБМ в России малочисленны, а с использованием сибсового метода не проводились вообще, особую значимость приобретает проведение подобного рода исследований среди населения России.

Цель исследования.

Целью настоящей работы является изучение вклада полиморфизма ряда генов-кандидатов в развитие ССЗ у больных с ангиографически подтвержденной ишемической болезнью сердца, у больных с хронической ишемической болезнью мозга и ишемическим инсультом, а также у их сибсов, с помощью сибсового и ассоциативного методов; изучение влияния полиморфных вариантов генов-регуляторов апоптоза на формирование инфаркта мозга и течение острого ишемического атеротромботического инсульта; выявление генетических маркеров данных заболеваний.

Задачи исследования.

1. Изучить частоты генотипов и аллелей по M235T полиморфизму гена ангиотензиногена (АТГ), инсерционно-делеционному полиморфизму гена ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), 4a/4b полиморфизму минисателлита гена эндотелиальной NO-синтетазы (eNOS), R219K и R1587K полиморфизмам гена АТФ-связывающего кассетного транспортера типа А1 (АВСА1), S19W и -1131T>C полиморфизмам гена аполипопротеина А-V (APOA5), C311S полиморфизму гена параоксоназы 2 (PON2), R72P полиморфизму гена р53 и С/А полиморфизму 3-фланкирующей области гена белка эфрина В3 (EFNB3) (полиморфизм GDB:181497) у больных ИБС, ИБМ и их сибсов.

2. Проанализировать возможное сцепление полиморфных участков каждого изучаемого гена с ИБС и ее основными клиническими проявлениями – инфарктом миокарда (ИМ) и стенокардией, а также с хронической ишемической болезнью мозга и инсультом, используя сибсовый тест на неравновесность передачи.

3. Провести корреляционный анализ изучаемых ДНК-маркеров с ИБС, ИБМ и основными клиническими проявлениями этих заболеваний в группах пробандов и сибсов.

4. Изучить полиморфизмы rs3219023 и rs2048426 в гене полимеразы 1 поли(АДФ)-рибозы (PARP1), полиморфизм rs189994 в гене апоптоз-индуцирующего фактора (AIF), полиморфизм rs2906766 в гене каспазы 9 (CASP9), С/А полиморфизм в 3-фланкирующей области гена белка эфрина В3 (EFNB3), IVS9-675C>A полиморфизм в гене индуцируемого гипоксией фактора 1 (HIF-1A) у больных с острым ишемическим атеротромботическим инсультом и проанализировать влияние этих полиморфизмов на формирование инфаркта мозга и течение заболевания.

5. Выявить генетические маркеры ИБС и ИБМ и оценить их вклад в развитие данных ССЗ.

Научная новизна работы.

Впервые, используя сибсовый метод, проведен анализ вклада десяти диаллельных ДНК-маркеров в развитие ИБС и ИБМ у лиц, относящихся к русскому этносу. Показано, что ни один из изучаемых генов-кандидатов ССЗ не является главным геном ИБС и ИБМ, что подчеркивает многофакторный характер этих заболеваний.

При изучении пар сибсов обнаружено, что инсерционно-делеционный (I/D) полиморфизм гена АПФ ассоциирован с развитием ишемической болезни сердца у лиц с отягощенным по ИБС семейным анамнезом. Генетическим маркером заболевания является генотип DD. Впервые показано, что DD генотип также ассоциирован с развитием ИБС у сибсов с отягощенной по инсульту наследственностью.

Впервые установлено, что R219K полиморфизм гена АВСА1 ассоциирован с развитием ИБС. Аллель 219К и генотипы, его содержащие (К219К, R219K), являются фактором повышенного риска развития и вариантом более тяжелого течения данного заболевания.

Установлено, что R1587K полиморфизм гена АВСА1 ассоциирован с развитием ИБС, инфаркта миокарда и стенокардии. Аллель R1587 и генотип R1587R являются фактором повышенного риска развития этих заболеваний у лиц с отягощенным семейным анамнезом.

Впервые обнаружена достоверная корреляция -1131Т/С полиморфизма гена АРОА5 с параметрами, характеризующими выраженность атеросклеротического процесса в коронарных артериях у больных ИБС. Показано, что генотипы -1131С/С и -1131Т/С ассоциированы с более высокой степенью поражения венечных артерий.

Впервые показана ассоциация R72P полиморфизма гена р53 с риском развития гипертрофии миокарда левого желудочка (ГЛЖ) у больных ИБС. Установлено, что аллель Р является протективным фактором и наличие в генотипе аллеля Р приводит к снижению риска развития ГЛЖ у этих больных.

Впервые установлено, что C311S полиморфизм гена PON2 ассоциирован с развитием инфаркта миокарда и гипертрофии миокарда левого желудочка у лиц с отягощенной по ИБС наследственностью. Фактором повышенного риска развития данных заболеваний является аллель C311 и генотип C311C.

Впервые проведен анализ вклада полиморфных вариантов ряда генов-регуляторов апоптоза в патогенез ишемического инсульта. Показана корреляция AG полиморфизма в первом интроне гена PARP1 (rs3219023) и С/А полиморфизма в 3-фланкирующей области гена EFNB3 (GDB:181497) с объемом инфаркта мозга и тяжестью состояния больных. Установлено, что генотип А/А по гену PARP1 и генотипы А/А и С/А по гену EFNB3 ассоциированы с развитием и прогрессированием инсульта и являются вариантом тяжелого течения заболевания у больных из России.

Впервые обнаружено, что аллель С по IVS9-675CA полиморфизму гена HIF-1A и генотипы С/С и С/А являются факторами повышенного риска развития ишемического инсульта в русской популяции.

Практическая значимость.

Полученные данные позволяют оценить роль ряда генетических систем в развитии таких ССЗ, как ишемическая болезнь сердца и ишемическая болезнь мозга, и являются основанием для разработки методов молекулярно-генетической идентификации лиц с повышенным риском развития данных заболеваний. Результаты молекулярно-генетического анализа полиморфных участков генов-кандидатов ССЗ могут использоваться для медико-генетического консультирования с целью раннего выявления лиц с высоким риском развития заболевания и проведения донозологической профилактики. Учитывая результаты генотипирования больных ИБС и ИБМ, возможно выделение группы пациентов с более тяжелым течением заболевания, что поможет дифференцировать у них лечебно-профилактические мероприятия.

Положения, выносимые на защиту.

1. Инсерционно-делеционный (I/D) полиморфизм гена АПФ ассоциирован с развитием ишемической болезни сердца у лиц с отягощенной по ИБС и по инсульту наследственностью. Маркером повышенного риска развития заболевания являются аллель D и генотип DD.

2. Полиморфизмы R219K и R1587K гена АВСА1 ассоциированы с развитием ишемической болезни сердца и ее основных клинических проявлений. Аллель 219К является фактором повышенного риска развития ИБС, стенокардии, артериальной гипертонии и вариантом более тяжелого течения данных заболеваний у лиц с отягощенной по ИБС наследственностью. Аллель R1587 ассоциирован с повышенным риском развития ИБС, инфаркта миокарда и стенокардии у лиц с отягощенным семейным анамнезом.

3. Полиморфизм -1131Т/С гена АРОА5 у больных ИБС коррелирует с параметрами, характеризующими выраженность атеросклероза в коронарных артериях – индексом стеноза и окклюзией сосудов. Генотипы -1131С/С и -1131Т/С ассоциированы с более высокой степенью поражения венечных артерий.

4. R72P полиморфизм гена р53 ассоциирован с развитием гипертрофии миокарда левого желудочка (ГЛЖ) у больных ИБС – аллель 72Р является протективным фактором и приводит к снижению риска развития ГЛЖ у больных ИБС. C311S полиморфизм гена PON2 ассоциирован с развитием гипертрофии миокарда левого желудочка, а также инфаркта миокарда у лиц с отягощенной по ИБС наследственностью – аллель C311 и генотип C311C являются фактором повышенного риска развития данных заболеваний.

5. Полиморфизм IVS9-675CA гена HIF-1A ассоциирован с развитием ишемического атеротромботического инсульта в русской популяции – фактором повышенного риска развития данного заболевания является аллель С и содержащие его генотипы С/С и С/А. Замена AG в первом интроне гена PARP1 (полиморфизм rs3219023) и С/А полиморфизм в 3-фланкирующей области гена EFNB3 (GDB:181497) коррелируют с объемом инфаркта мозга у больных с острым атеротромботическим инсультом и тяжестью их состояния. Генотип А/А по гену PARP1, генотипы А/А и С/А по гену EFNB3 являются вариантом более тяжелого течения инсульта и дальнейшего прогрессирования патологического процесса.

6. M235T полиморфизм гена АТГ, 4a/4b полиморфизм гена eNOS, S19W полиморфизм гена АРОА5, полиморфизм rs189994 гена AIF и полиморфизм rs2906766 гена CASP9 не ассоциированы с развитием ИБС и ИБМ в русской популяции и не оказывают влияния на течение этих сердечно-сосудистых заболеваний у больных из России.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Апробация диссертации.

Результаты, полученные в данной работе, были представлены на конференциях Американского Общества Генетики Человека (ASHG) 2003-2004 г.г., Европейского Общества Генетики человека (ESHG) 2003-2006 г.г., съездах Российского общества медицинских генетиков 2001 и 2005 г.г., изложены на конкурсах работ на стипендию фонда «Будущее молекулярной генетики» (Москва, ИМГ РАН, 2004 и 2006 г.г.). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на научном семинаре Медико-генетического научного центра РАМН 22 июня 2006 г.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения; 3-х глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение; выводов; библиографического указателя. Список литературы состоит из 411 источников, среди которых 36 источников отечественной и 375 источников зарубежной литературы.

Текст диссертации изложен на 196-ти страницах машинописного текста, иллюстрирован 31 таблицей и 20 рисунками.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В исследование были включены пациенты, относящиеся к русскому этносу, после подписания ими или их ближайшими родственниками информированного согласия об участии в исследовании.

В первую группу были включены 85 пациентов с ишемической болезнью сердца, составляющих выборку пробандов, и 100 их родных братьев и сестер, составляющих выборку сибсов. Выборка сибсов является независимой выборкой неродственных друг другу индивидуумов, но представляет собой смещенную выборку, так как она сформирована на основании родства каждого сибса с соответствующим пробандом. Наличие родства между сибсом и больным ИБС в каждой отдельной паре пробанд-сибс позволяет охарактеризовать сибсов как выборку лиц с семейной предрасположенностью к развитию ишемической болезни сердца.

Всем лицам, включенным в исследование, проводилось комплексное клинико-инструментальное обследование. Диагноз ИБС был поставлен на основании анализа совокупности данных анамнеза, физикального обследования, биохимических показателей крови и клинико-инструментальной диагностики и затем был верифицирован с помощью коронароангиографии (КАГ). КАГ проводилась всем пробандам, а также сибсам, у которых на основании всего комплекса диагностических исследований была выявлена ИБС.

Во вторую группу было включено 85 больных с ишемическим атеротромботическим инсультом и 93 их сибса, 48 больных с хронической ИБМ и 53 их сибса; а также 60 больных с острым ишемическим атеротромботическим инсультом, поступивших в неврологическое отделение ГКБ №20 и ГКБ №31 г. Москвы в первые 12 часов с момента развития заболевания. Диагноз каротидного ишемического атеротромботического инсульта основывался на сборе данных анамнеза развития заболевания; исследовании соматического и неврологического статусов; данных клинико-инструментальных методов исследования.

Для типирования полиморфных вариантов изучаемых генов-кандидатов ССЗ были использованы препараты ДНК, полученные из 5 мл венозной крови пробандов и их сибсов. Выделение ДНК из лейкоцитов венозной крови человека проводилось стандартным методом фенол-хлороформной экстракции [Sambrook et al., 1989]. Определение полиморфизма проводилось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей рестрикцией амплифицированного фрагмента ДНК соответствующими рестриктазами.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ “Statistica for Windows 6.0”, программного обеспечения MS Excel 2000 (Microsoft), компьютерной программы RxC (Rows and Columns) [Roff D.A., Bentzen P., 1989] и программы для оценки неравновесия по сцеплению в парах сибсов (sibs transmission/disequilibrium test– S-TDT) [Spielman R.S., Ewens W.J., 1998]. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя относительного риска (ОР) по формуле:

ОР = [A/(A+B)] / [C/(C+D)], где A – число лиц с наличием, B – с отсутствием маркера среди больных; C и D – число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера среди здоровых.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Изучение вклада полиморфизма генов АТГ, АПФ, eNOS, ABCA1, APOA5, PON2, р53, EFNB3 в развитие ИБС и ИБМ проводилось в несколько этапов с помощью ассоциативного метода в выборках различных типов.

Ассоциативный анализ ДНК маркеров с использованием теста неравновесности передачи в парах сибсов.

На первом этапе для оценки возможной ассоциации между данными генами и заболеванием был использован непараметрический S-TDT. Этот метод основан на совместном анализе распределения в парах сибсов аллельных вариантов исследуемого гена и клинических фенотипов. Он позволяет выявить высоко значимые ассоциации (сильное сцепление) между геном и заболеванием. С этой целью использовалась величина z-балла. Достоверными считали значения р менее 0.05, чему для диаллельных ДНК-маркеров соответствует значение z-балла более 2,47 Spielman R.S., Ewens W.J., 1998.

В результате проведенного анализа не было установлено сцепления между исследуемыми полиморфизмами генов АТГ, АПФ, eNOS, ABCA1, APOA5, PON2, р53, EFNB3 и ишемической болезнью сердца, а также ее основными клиническими проявлениями – инфарктом миокарда и стенокардией. z-балл не достигает значения 2,47 (p0,05). Не было выявлено сцепления между изучаемыми генами и ишемическим инсультом, а также хронической ишемической болезнью мозга.

Таким образом, анализ ассоциации с использованием S-TDT показал, что ни один из исследуемых генов не является главным геном, отвечающим за развитие таких заболеваний, как ИБС и ИБМ. Патогенез этих ССЗ обусловлен сложным взаимодействием различных генетических факторов друг с другом, а также с факторами внешней среды.

Корреляционный анализ в группах пробандов с ИБС и их сибсов.

На следующем этапе для изучения возможного вклада каждого из генов-кандидатов ИБС в развитие патологического процесса проводился поиск ассоциаций для выявления возможных связей между анализируемым полиморфизмом гена и заболеванием в группе пробандов и в группе их сибсов. Для этого был выполнен непараметрический корреляционный анализ (метод ), позволивший проанализировать корреляции между десятью ДНК-маркерами и клиническими признаками, описывающими состояние сердечно-сосудистой системы у больных ИБС и их сибсов. Выявленные статистически достоверные корреляции были затем проанализированы с использованием других более жестких методов статистического анализа (точный двусторонний критерий Фишера, критерий Ньюмана-Кеулса).

Анализ вклада R219К полиморфизма гена АТФ-связывающего кассетного транспортера типа А1 в развитие ИБС.

В результате корреляционного анализа в группе пробандов нами были выявлены статистически достоверные корреляции R219К полиморфизма гена АВСА1 с параметрами, характеризующими выраженность атеросклеротического поражения коронарных артерий – сосудистым индексом ( = -0.318, р = 0.006), индексом стеноза ( = -0.328, р = 0.001), окклюзией ( = -0.326, р = 0.027); стенокардией по функциональному классу (ФК) ( = -0.295, р = 0.011); хронической сердечной недостаточностью (ХСН) ( = -0.297, р = 0.039). В группе сибсов данный полиморфизм достоверно коррелирует с ИБС ( = -0.325, р = 0.012); стенокардией ( = -0.378, р = 0.007); артериальной гипертонией (АГ) ( = -0.325, р = 0.008); гипертрофией ЛЖ ( = -0.397, р = 0.011); уровнем ХС ЛПОНП ( = -0.229, р = 0.01) и ТГ ( = -0.259, р = 0.003).

На следующем этапе каждая достоверная корреляция анализировалась путем сравнения частоты аллельных вариантов данного полиморфного локуса у лиц с разными фенотипами. В связи с низкой численностью гомозигот по редкому аллелю 219К гена АВСА1 пациенты с генотипами К219К и R219К были объединены в одну группу.

В группе пробандов оценивалась степень атеросклеротического поражения коронарных артерий у пациентов с разными генотипами по результатам КАГ с помощью трех параметров: сосудистого индекса, индекса стеноза и наличия окклюзии крупных сосудов.

При изучении распределения средних значений индекса стеноза у пробандов с разными генотипами по гену АВСА1 было выявлено, что средние значения этого индекса достоверно выше в объединенной группе больных с генотипами К219К и R219К (10,07±4,15) при сравнении с гомозиготами по R219 аллелю (7,29±4,57), р = 0,004.

Обнаружено, что у пациентов с К219К и R219К генотипами достоверно чаще наблюдается 2-х и 3-х сосудистое поражение коронарных артерий, а у лиц с R219R генотипом – 1-о сосудистое поражение (² = 7.44, р = 0.001, таблица 1). Таким образом, К219К и R219К генотипы гена АВСА1 ассоциированы с более тяжелым атеросклеротическим поражением коронарных артерий.

Таблица 1. Сосудистый индекс, характеризующий степень атеросклеротического поражения коронарных артерий у больных ИБС с разными генотипами по R219К полиморфизму гена АВСА1.

Параметры		Генотипы KK и RK	Генотип RR	р
Сосудистый индекс	1	11%	41%	0,001
	2	48%	27%
	3	41%	32%

следующая страница >>