Метод выявления дрожжей и плесневых грибов в пищевых

Утверждаю
Заместитель Главного
государственного
санитарного врача
Российской Федерации -
Главный врач Федерального
центра госсанэпиднадзора
Минздрава России
Е.Н.БЕЛЯЕВ
20 февраля 2004 г. N 24ФЦ/900
Дата введения:
20 февраля 2004 года
МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ ДРОЖЖЕЙ И ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ В ПИЩЕВЫХ

ПРОДУКТАХ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Разработаны: Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России, ОАО

"Лианозовский молочный комбинат", фирмой "Лаб-БиоМед".

2. Утверждены и введены в действие Заместителем главного государственного санитарного

врача Российской Федерации - Главным врачом Федерального центра госсанэпиднадзора Минздрава

России Е.Н. Беляевым.
3. Введены впервые.
1. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие Методические рекомендации устанавливают методы проведения лабораторных

исследований по выявлению дрожжей и плесневых грибов в определенной навеске пищевых

продуктов.
1.2. Методические рекомендации разработаны в соответствии с Федеральным законом "О
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
санитарно-эпидемиологическом благополучии населения", Положением о государственном

санитарно-эпидемиологическом нормировании, Положением о государственной санитарно-

эпидемиологической службе Российской Федерации.
1.3. Методические рекомендации предназначены для применения в лабораториях пищевой

промышленности, осуществляющих производственный контроль пищевых продуктов.

2. Нормативные ссылки
2.1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" N 52-ФЗ

от 30 марта 1999 г.

2.2. Закон РФ "О защите прав потребителей" от 7 февраля 1992 г.
2.3. Закон РФ "О качестве и безопасности пищевых продуктов" N 29-ФЗ от 2 января 2000 г.
2.4. "Положение о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской

Федерации", утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации N 554 от 24 июля

2000 г.
2.5. "Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании",

утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации N 554 от 24 июля 2000 г.

2.6. СП 1.2.731-99. Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и

гельминтами.

2.7. ГОСТ 26668-85. Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических

анализов.

2.8. ГОСТ 26669-85. Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических

анализов.

2.9. ГОСТ 26670-91. Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов.
2.10. ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96). Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила

микробиологических исследований.

2.11. ГОСТ 10444.12-88. Продукты пищевые. Метод определения дрожжей и плесневых грибов.
2.12. ГОСТ 9225-84. Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа.
2.13. ГОСТ 26809-86. Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и

подготовки проб к анализу.

2.14. ГОСТ 28805-90. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества

осмотолерантных дрожжей и плесневых грибов.

2.15. ГОСТ 19569-89. Стерилизаторы паровые медицинские. Общие технические требования и

методы испытаний.

2.16. ГОСТ 24104-2001. Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие

технические условия.

Общие требования.

2.18. ГОСТ 16317-87. Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические

условия.
2.19. ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные

параметры и размеры.
2.20. ГОСТ 23932-90. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические

условия.
2.21. ГОСТ 18300-87. Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия.

3. Требования к помещениям и технике безопасности
3.1. Требования безопасности, общее расположение лаборатории, а также ее инфраструктура

должны удовлетворять требованиям СП 1.2.731, ГОСТ Р 51446.

4. Аппаратура, материалы, питательные среды <*>
--------------------------------
<*> Производство питательных сред компании Merck KGaA имеет международный сертификат

качества ISO 9001:2000.

4.1. Термостат, позволяющий поддерживать рабочую
      температуру 30 °С с отклонением от заданной
      +/- 1 °С
4.2. Автоклав или стерилизатор паровой медицинский     ГОСТ 19569
4.3. Облучатель бактерицидный
4.4. Весы лабораторные с наибольшим пределом           ГОСТ 24104
      взвешивания 200 г и допустимой погрешностью
      +/- 2 мг
4.5. Шкаф сушильно-стерилизационный, обеспечивающий
      поддержание заданного температурного режима в
      диапазоне от 50 до 200 °С с погрешностью
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
      +/- 2 °С
4.6. Микроскоп световой биологический с увеличением
                х
      900 - 1000
4.7. Холодильник, позволяющий поддерживать             ГОСТ 16317
      температуру +2 - 4 °С
4.8. Гомогенизатор бактериологический
      перистальтического типа Masticator
      (или аналогичный) со стерильными
      полиэтиленовыми пакетами
4.9. Пипетки градуированные 1-го и 2-го классов        ГОСТ 29227
      точности вместимостью 1 куб. см, 10 куб. см
4.10. Пробирки бактериологические вместимостью          ГОСТ 25336
      10 куб. см
4.11. Чашки бактериологические (Петри)                  ГОСТ 23932
4.12. Посуда широкогорлая                               ГОСТ 25336
4.13. Горелка газовая или спиртовая                     ГОСТ 25336
4.14. Шпатели 15 - 20 см
4.15. Спирт этиловый ректификованный технический        ГОСТ 18300
4.16. Метиленовый синий
4.17. Жидкая среда Сабуро 2% глюкозы                    Merck
                                                        Cat. N

1.08339.0500

4.18. Селективный агар YGC с хлорамфениколом Merck
Cat. N

1.16000.0500

Допускается применение других средств измерения и оборудования с аналогичными

характеристиками.

5. Сущность метода
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Метод основан на высеве определенного количества продукта в жидкую среду для обогащения;

инкубировании посевов; последующем пересеве культуральной жидкости на поверхность

агаризованной селективной среды с антибиотиком для выделения и дифференциации дрожжей и

плесневых грибов по характеру роста.

6. Методы отбора проб
Отбор проб пищевых продуктов, маркировка, сопроводительная документация,

транспортировка и хранение в соответствии с ГОСТ 26668, ГОСТ 26809, ГОСТ 92225 и нормативно-

технической документацией на анализируемый вид продукта.
7. Порядок подготовки к испытанию
7.1. Подготовка посуды и материалов в соответствии с ГОСТ 9225.
7.2. Состав, приготовление и условия хранения питательных сред.
7.2.1. Жидкая среда Сабуро 2% глюкозы (п. 4.17).
Состав среды в (г/куб. дм)
Пептон из мяса - 5,0;
Пептон из казеина - 5,0;
Глюкоза - 20,0.
Приготовление среды
В 1 куб. дм дистиллированной воды растворить 30 г сухой питательной среды. Стерилизовать в

автоклаве при температуре (121 +/- 1) °С 15 минут.

Жидкая среда прозрачная, слегка желтоватая.
рН приготовленной среды: 5,6 +/- 0,2 при 25 °С.
Условия хранения
Приготовленная среда храниться в холодильнике при температуре (2 - 4) °С. Срок хранения

готовой среды - 3 месяца.

7.2.2. Селективный агар YGC с хлорамфениколом (п. 4.18).
Состав среды в (г/куб. дм)
Дрожжевой экстракт - 5,0;
Глюкоза - 20,0;
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Хлорамфеникол - 0,1;
Агар-агар - 14,9.
Приготовление среды
В 1 куб. дм дистиллированной воды растворить 40 г сухой питательной среды. Стерилизовать в

автоклаве при температуре (121 +/- 1) °С 15 минут.

Приготовленные чашки со средой прозрачные, слегка желтоватые.
рН приготовленной среды: 6,6 +/- 0,2 при 25 °С.
Условия хранения
Чашки со средой хранить в холодильнике при температуре (2 - 4) °С. Срок хранения готовой

среды на чашках - 4 месяца.

7.3. Приготовление раствора метиленового синего (концентрация 10 г/куб. дм).
Метиленовый синий в количестве 1,0 г перенести в фарфоровую ступку и растворить в

дистиллированной воде. Раствор перенести в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и долить до

метки.
Раствор хранить в закрытой посуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3

месяцев.
7.4. Подготовка проб к испытанию

7.4.1. Подготовку проб пищевых продуктов проводят в соответствии с ГОСТ 26669, ГОСТ 9225.
8. Порядок проведения испытания
8.1. Для посева навеску продукта, в массе (объеме) которой предусматривается отсутствие

дрожжей и плесневых грибов, отобрать весовым или объемным методом, внести в жидкую среду

Сабуро, приготовленную по п. 7.2.1, и тщательно перемешать.
Соотношение массы (объема) продукта и жидкой среды 1:4.
Твердые образцы при необходимости следует измельчить в гомогенизаторе.
Посевы инкубировать при температуре (30 +/- 1) °С в течение (48 +/- 3) часа.
Дополнительно.
Рост дрожжей в жидкой среде Сабуро сопровождается, как правило, появлением мути,

специфического запаха, брожения и газа.

8.2. После инкубирования по п. 8.1, посевы в количестве 0,1 куб. см внести на поверхность

селективной агаризованной среды, YGC с хлорамфениколом, приготовленной по п. 7.2.2, и

равномерно растереть шпателем.
8.2.1. Для предварительного выявления дрожжей и плесневых грибов инкубировать при
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
температуре (30 +/- 1) °С в течение (24 +/- 2) часа.
8.2.2. Для окончательного выявления дрожжей и плесневых грибов инкубировать при

температуре (30 +/- 1) °С в течение (48 +/- 3) часа.

8.3. После инкубирования по п. 8.2.1 провести предварительную оценку результатов.
8.3.1. Наличие видимого роста колоний на селективной агаризованной среде YGC с

хлорамфениколом указывает на присутствие дрожжей и плесневых грибов в исследуемом продукте.

8.3.2. Отсутствие роста на агаризованной среде YGC с хлорамфениколом указывает на

возможное отсутствие дрожжей и плесневых грибов в исследуемом продукте.

8.4. После инкубирования по п. 8.2.2 провести окончательную оценку результатов.
8.4.1. Отсутствие роста на агаризованной среде YGC с хлорамфениколом указывает на

отсутствие дрожжей и плесневых грибов в исследуемом продукте.

8.4.2. Наличие характерных колоний на селективной агаризованной среде YGC с

хлорамфениколом указывает на присутствие дрожжей или плесневых грибов в исследуемом

продукте.
Рост дрожжей на агаризованной среде сопровождается образованием выпуклых, блестящих или

матовых серовато-белых колоний.

Рост плесневых грибов сопровождается появлением плоских или пушистых разрастающихся

колоний, часто с окрашенными, плодоносящими или спорообразующими структурами; окраска

варьирует.
Дополнительно.
При необходимости для дифференциации дрожжей и плесневых грибов провести

микроскопическое исследование. Дня этого из отдельных колоний приготовить мазки и окрасить их

раствором метиленового синего, приготовленного по п. 7.3, выдержать 5 мин., слить краску,

высушить на воздухе и микроскопировать. При микроскопировании дрожжи - одноклеточные

микроорганизмы, клетки круглой, овальной или продолговатой формы, часто почкующиеся.

Плесневые грибы состоят из нитей-гифов без перегородок; гифы образуют боковые выросты и

разветвления.
Схема проведения испытаний приведена в Приложении N 1.
9. Учет и оценка результатов испытания
Если при испытании продукта на питательных средах обнаружен характерный рост дрожжей

или плесневых грибов, то выдается заключение о наличии этих микроорганизмов в продуктах.

Результаты выявления дрожжей и плесневых грибов в определенной навеске продукта

записывают:

Дрожжи или/и плесневые грибы выявлены (не выявлены) в Х г (куб. см) продукта, где Х - масса

(объем) навески продукта, в которой выявляли дрожжи и плесневые грибы.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Приложение N 1
МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ ДРОЖЖЕЙ И ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ
В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
                                 ---------¬
                                 ¦ Образец ¦
                                 L----T----
                                     \/
                   ------------------------------------¬
                   ¦         жидкая среда Сабуро        ¦
                   ¦ соотношение (образец:среда) = (1:4) ¦
                   L------------------T-----------------
                                     \/
                            ------------------¬
                            ¦ 48 +/- 3 ч, 30 °С ¦
                            L---------T--------
                          0,1 куб. см\/
                 ---------------------------------------¬
                 ¦ Селективный агар YGC с хлорамфениколом ¦
                 L--------------------T------------------
                                     \/
                              ------------------¬
                              ¦ 24 +/- 2 ч, 30 °С ¦
                              L-------T----------
                                     \/
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
                    ---------------------------------¬
                    ¦ Предварительный учет результатов ¦
                    L---------------------------------
              ---------------------¬      ---------------------¬
              ¦ Отсутствие роста ¦      ¦     Наличие роста   ¦
              ¦ ДРОЖЖИ И ПЛЕСНЕВЫЕ ¦      ¦ ДРОЖЖИ ИЛИ ПЛЕСНЕВЫЕ ¦
              ¦ ГРИБЫ ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ¦      ¦        ГРИБЫ        ¦
              ¦      НЕ ВЫЯВЛЕНЫ    ¦      ¦       ВЫЯВЛЕНЫ      ¦
              L---------T-----------      L--------T------------
                       \/                        \/
               ------------------¬         ------------------¬
               ¦ 24 +/- 2 ч, 30 °С ¦         ¦ 24 +/- 2 ч, 30 °С ¦
               L-------T----------         L-------T----------
                      \/                         \/
----------------------------------------¬    -----------------------¬
¦     Окончательный учет результатов     ¦    ¦ Дифференциация дрожжей ¦
L----------------------------------------    ¦ и плесневых грибов ¦
-----------------¬       ----------------¬    L-----------------------
¦ Отсутствие роста ¦       ¦ Наличие роста ¦
¦    ДРОЖЖИ ИЛИ   ¦       ¦    ДРОЖЖИ ИЛИ ¦
¦ ПЛЕСНЕВЫЕ ГРИБЫ ¦       ¦ ПЛЕСНЕВЫЕ ГРИБЫ ¦
¦    НЕ ВЫЯВЛЕНЫ ¦       ¦     ВЫЯВЛЕНЫ   ¦
L-----------------       L----------------
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.