Генетическая структура и ключевые факторы выживания краевой популяции маньчжурского фазана phasianus colchicus pallasi Rothschild, 1903 03. 02. 04 зоология 03. 02. 07 генетика

На правах рукописи

ФИСЕНКО Петр Викторович

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА И КЛЮЧЕВЫЕ ФАКТОРЫ ВЫЖИВАНИЯ КРАЕВОЙ ПОПУЛЯЦИИ МАНЬЧЖУРСКОГО ФАЗАНА Phasianus colchicus pallasi Rothschild, 1903

03.02.04 – зоология

03.02.07 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Владивосток – 2012

Работа выполнена в лаборатории эволюционной зоологии и генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Биолого-почвенный институт ДВО РАН.

Научный руководитель: Доктор биологических наук,

академик РАН

Журавлев Юрий Николаевич

Официальные оппоненты: Назаренко Александр Александрович

доктор биологических наук,

ФГБУН Биолого-почвенный институт

ДВО РАН

главный научный сотрудник

Заславская Надежда Ивановна

кандидат биологических наук

ФГБУН Институт биологии моря ДВО РАН

доцент, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт водных и

экологических проблем ДВО РАН,

г. Хабаровск

Защита состоится 30 октября 2012 г., в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.003.03 при Биолого-почвенном институте ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, пр-т 100-летия Владивостока, 159.

Факс: (4232) 310-193. E-mail: ibss@eastnet.febras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН.

Автореферат разослан «___» ___________ 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук Е.М. Саенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Фазан обыкновенный – Phasianus colchicus Linnaeus, 1758 – является сложно организованным политипическим видом, широко распространненым в умеренной, частично субтропической зонах Восточной, Внутренней и Западной Азии, вплоть до Кавказа (Vaurie, 1965; Козлова, 1970 и др.). Фазан обладает высокими эстетическими и гастрономическими достоинствами, что делает его крайне привлекательным объектом спортивной любительской охоты.

На юге материкового Дальнего Востока России и прилежащем северо-восточном Китае обитает подвид Phasianus colchicus pallasi Rothschild, 1903, именуемый маньчжурским фазаном. Биология этой популяции в целом изучена достаточно полно (Шульпин, 1936; Воробьев, 1954; Потапов, 1987 и др.). И тем не менее один аспект биологии этого подвида требует дальнейшего выяснения: это зимняя экология популяции. Зимний период в бассейне р. Амур по своей суровости – сочетание низких температур и значительного снежного покрова – не имеет прецедентов в любых других областях обитания вида, включая северо-восточный Тибет. Поэтому имеются серьезные основания считать этот период наиболее критическим в жизни маньчжурского фазана. Более того, высказана гипотеза, что популяция маньчжурского фазана, как и значительная группа других видов птиц на восточной окраине Азии, в данном регионе полностью антропогенно зависима (Назаренко, 1999).

Включение в научный обиход современных методов и моделей популяционной молекулярной генетики открывает возможность оценить возраст и историю популяций животных в конкретных регионах (Rogers, Harpending, 1992; Ramos-Onsins, Rosas, 2002; и др.). Применительно к маньчжурскому фазану, эти временные оценки в сочетании с хорошо датированным костным материалом фазана из археологических памятников и пещерных отложений (Александрова и др., 1984; и др.) позволяют дать конкретные оценки времени заселения популяцией фазана бассейна р. Амур и юга Дальнего Востока России в целом. А современные строгие связи популяции с антропогенным (аграрным) ландшафтом (Шульпин, 1936; Глущенко, 2006; и др.) позволяют выяснить предпосылки этой территориальной экспансии.

Цель исследования – изучить генетическую изменчивость и ключевые факторы выживания популяции маньчжурского фазана на Дальнем Востоке России с целью реконструкции его истории.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

Выяснить генетическое разнообразие и генетическую структуру популяции маньчжурского фазана на основе анализа последовательностей контрольного региона мтДНК.
Провести сопоставление родственных (филогенетических) отношений данной популяции с популяциями из прилежащих регионов восточного и центрального Китая с использованием последовательностей мтДНК из базы данных GenBank.
На основании полученных данных провести реконструкцию демографической истории популяции при помощи существующих математических моделей и сопоставить результаты с палеонтологическими датировками.
Выяснить и оценить связи фазанов с антропогенным ландшафтом в осенне-зимний период по данным маршрутных учетов.
Изучить особенности образа жизни фазана в природно-антропогенном ландшафте в холодное время года.

Научная новизна и практическая ценность работы:

Получены новые данные о трофических связях и динамике численности фазана в осенне-зимний период в Южном Приморье. Выявлены особенности поведения и экологии вида, обеспечивающие его выживание в зимний сезон и поддержание достаточно высокой численности в природно-антропогенных и антропогенных биотопах.

Впервые исследована генетическая изменчивость популяции фазана маньчжурского на Дальнем Востоке России с помощью анализа нуклеотидных последовательностей контрольного региона митохондриальной ДНК. Проведен ряд анализов для изучения структуры контрольного региона мтДНК, генетической структуры современной популяции, характер филогенетических взаимоотношений гаплотипов внутри популяции, а также ее демографической истории. Данные, полученные с помощью анализа распределения попарных различий (mismatch distributions), модели внезапного расселения и тестов на популяционную стабильность свидетельствуют о молодости популяции на исследованной территории, быстром популяционном росте и быстрой экспансии в постледниковый период. Результаты исследования свидетельствуют об однородности популяции по всей территории Дальнего Востока РФ. Впервые обнаруженные в данном исследовании гаплотипы депонированы в базу данных GenBank EMBL/NCBI.

Полученные данные могут быть использованы в учебном процессе, при изучении курса зоологии в ВУЗах, сотрудниками филиала ФГУ «Россельхозцентр» по Приморскому краю и Управления по охране, контролю и регулированию использования объектов животного мира Приморского края в целях сохранения и рационального использования маньчжурского фазана как компонента регионального биоразнообразия России.

Апробация работы. Материалы диссертации изложены на международных, всероссийских и региональных конференциях: VIII Дальневосточной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (МЭС ТИБОХ 2004 г.), X Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий. Экологический катализ» (Новосибирск 2005 г.), V съезде ВОГИС (Москва 2009 г.), конференции-конкурсе молодых ученых БПИ ДВО РАН (Владивосток 2009 г.), международном симпозиуме «Modern ahievements in population, evolutionary and ecological genetics» (Владивосток, 2009 и 2011 гг.) на заседаниях лаборатории эволюционной зоологии и генетики и отдела зоологии Биолого-почвенного института ДВО РАН (2012 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 2 статьи в журналах из списка ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 122 страницах текста, содержит 17 таблиц и 15 рисунков. Список литературы включает 186 работ, в том числе 115 на иностранных языках.

Благодарности. Автор выражает благодарность д.б.н. Ю.Н. Журавлеву за предоставленные образцы и материально-техническую базу; к.б.н. О.Г. Корень за помощь в освоении метода аллозимного анализа; к.б.н. М.М Козыренко за помощь в освоении метода секвенирования ДНК; сотрудников лаб. Эволюционной зоологии и генетики БПИ ДВО РАН, а в особенности д.б.н. А.П. Крюкову, д.б.н. И.В. Картавцевой и к.б.н. И.Н. Шереметьевой за всестороннюю помощь и поддержку; за критические замечания и консультативную помощь искренне признателен к.б.н. Ю.Н. Глущенко, д.б.н. В.А. Нечаеву, д.б.н. Г.Н. Челоминой и к.б.н. С.А. Шабалину; благодарен директору Амурского филиала БСИ ДВО РАН к.б.н. О.В. Жилину за помощь в сборе образцов в Амурской области. Я искренне признателен моим родителям, П.П. Фисенко и В.Ф. Фисенко, а также благодарю М.В. Ромашову и Н.В. Мацишину за неоценимую поддержку и глубокую убежденность в силы автора.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ВВЕДЕНИЕ

Во введении обоснована актуальность выбранной темы, сформулированы цель и основные задачи исследования, указаны научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы.

Глава 1. ОБЫКНОВЕННЫЙ ФАЗАН: ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ВИДА
В главе приведен обзор литературы. Описана история изучения фазана на Дальнем Востоке РФ, в том числе современное исследование генетического разнообразия этого вида рядом методов. Приведена характеристика вида. Описаны морфо-физиологические особенности и динамика численности маньчжурского подвида обыкновенного фазана, обитающего на Дальнем Востоке России и занимающего самую северную часть видового ареала.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В основу работы положены пробы тканей, предоставленные директором БПИ ДВО РАН Ю. Н. Журавлевым, а также собственные сборы и наблюдения автора в 2007-2011 гг. Всего использовано 165 образцов тканей печени фазанов (автором собрано 25) из четырех географических точек российского Дальнего Востока – Хасанский и Ханкайский районы Приморского края, Еврейская автономная область и Амурская область (рис. 1).

Рис. 1. Места сбора материала для изучения генетической изменчивости на территории юга Дальнего Востока РФ.

Изучение генетического полиморфизма методом аллозимного анализа. Проанализированы 52 особей Ph. colchicus pallasi добытых в Ханкайском и Пограничном районах Приморского края. Образцы хранили в замороженном виде при –20⁰С. Экстракцию ферментов из тканей печени проводили растиранием образцов тканей с сухим поливинилпироллидоном (ПВП) с добавлением 10% раствора сахарозы, содержащего 1%

-меркаптоэтанола. После экстракции гомогенаты центрифугировали в течение 3 мин. при 10000 оборотах/мин.

Для электрофоретического разделения изоферментов мы использовали горизонтальный электрофорез в 14% крахмальном геле с использованием 11 ферментов в двух буферных системах (а – трис-ЭДТА-боратная рН=8.0; б – трис-цитратная рН=6.2). В буферной системе «а» разделялись ферменты – эстераза (EST), глутаматдегидрогеназа (GDH), сорбитолдегидрогеназа (SDH), алклгольдегидрогеназа (ADH), фосфоглюкомутаза (PGM), глюкозофосфатизомераза (GPI); в буферной системе «б» - кислая фосфотаза (АСР), малик-энзим (МЕ), малатдегидрогеназа (MDH), 6-фосфоглюконат-дегидрогеназа (6-PGD), лактатдегидрогеназа (LDH). Гистохимическое выявление проводили по стандартным методикам (Левитес 1986; Гончаренко, 1989).

Изучение генетического полиморфизма контрольного региона мтДНК. Контрольный регион мтДНК исследовали у 104 особей фазана маньчжурского Phasianus colchicus pallasi из четырех географических точек Дальнего Востока: 33 особи – Амурская область (АО): окрестности сел Гродеково, Николаевка, Кани-Курган, Тамбовка, Липовка, Волково и Марково; 22 птицы – Еврейская автономная область (ЕАО): окрестности сел Новое и Калинино; 23 птицы – Ханкайский р-н (Ханка): окрестности сел Платоновка и Первомайское и 26 птиц - Хасанский р-н (Хасан): оз. Птичье, р. Карасик. Печень фазанов фиксировалась 96% этанолом. Фиксированные ткани хранились в морозильной камере при -20⁰С.

ДНК экстрагировали из 200 мг фиксированной спиртом ткани печени стандартным фенолхлороформным методом (Sambrook, Fritsch, Maniatis, 1989). Количество ДНК в образце определяли путем сравнения с ДНК фага лямбда известной концентрации методом электрофореза в 1.4% агарозном геле.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и секвенирование. Фрагмент митохондриального генома фазанов, включающий контрольный регион (D-петля) был амплифицирован методом ПЦР с использованием прямого H19 и обратного L1097 праймеров (табл. 1). Амплификацию проводили в термоциклере UNO II 48 ("Biometra", Германия) в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 30-50 нг геномной ДНК, 0.2 мкМ каждого праймера фирмы "Синтол", а также ПЦР-буфер, Taq-полимеразу и смесь дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) из набора Taq PCR Core Kit фирмы "QIAGEN". Температурный режим включал преденатурацию - 94°С/7 мин, затем 44 цикла: денатурация - 94°С/20 с; отжиг праймеров - 52°С/20 с; элонгация - 72°С/1 мин; и постэлонгация - 72°С/7 мин. Контрольная проба содержала полную амплификационную смесь, но без добавления ДНК. Продукты реакции анализировали в 1.4%-ном агарозном геле в трис-ЭДТА-боратном буфере. Концентрацию продуктов амплификации определяли путем сравнения с ДНК фага лямбда известной концентрации, а для определения длины фрагмента использовали EcoRI+HindIII-рестрикты ДНК фага лямбда (“Fermentas”, Литва).

Продукты амплификации подвергали циклическому секвенированию с помощью набора реактивов ABI PRISM®BigDye^TM Terminator v. 3.1. в одной реакции с каждым из 5 праймеров: H19 и L1097, а также дополнительных внутренних - прямого H636 и двух обратных - L612 и L708 (табл. 1). Температурный профиль циклического секвенирования: преденатурация – 96°С/ 1 мин., затем 25 циклов: денатурация – 96°С/30 с; отжиг – 55°С/10 с; элонгация – 60°С/4 мин. Определение нуклеотидной последовательности ДНК обеих цепей (прямой и обратной) проводили на генетическом анализаторе ДНК ABI PRISM 310 (Applied Biosystems).

Таблица 1

Праймеры для секвенирования контрольного региона маньчжурского фазана

Праймер	Нуклеотидная последовательность (5' → 3')
H19	AACTCCCCTATTgAATgTACCC
H636	TgCggAgTgCTATTCAAgTg
L612	TgAAgAAgCCCCAgAgAAAA
L708	CgAgggACACgAgAggACTA
L1097	AATTTgTggggTTTTgTCCT

Анализ нуклеотидных последовательностей и филогенетические построения. Различные манипуляции по подготовке последовательностей к последующему анализу, включая их выравнивание, осуществляли с использованием программ из пакета Staden 1.53 (Staden, 1999) и программы Seaview (Galtier, 1996). Иерархический анализ молекулярных изменений AMOVA и расчет таких популяционных параметров, как гаплотипическое (h) и нуклеотидное (π) разнообразие, условный размер предковой гаплоидной популяции (θ₀), условный размер современной гаплоидной популяции (θ₁) и возраст современной популяции (τ), а так же MST-деревья были выполнены в программе ARLEQUIN ver. 3.01 (Excoffier, 2005). Тесты на популяционную стабильность: D (Tajima, 1989), F (Fu, Li, 1993), F_S (Fu, 1997) и R2 (Ramos-Onsins, Rosas, 2002), анализ распределения парных различий (mismatch distributions) (Rogers, Harpending, 1992) были проведены с помощью программы DnaSP 4.10.9 (Rozas, 2003). Значения дивергенции между нуклеотидными последовательностями (р-дистанции) получены с помощью пакета программ MEGA3 (Kumar, Tamura, Nei, 2004). Визуализацию возможных вариантов мутационных переходов между мтДНК-гаплотипами осуществляли с помощью программы TCS версии 1.21 (Clement, Posada, Crandall, 2000).

Для филогенетических реконструкций нами были использованы последовательности контрольного региона, хранящиеся в базе данных GenBank/NCBI, двух видов фазанов - Ph. colchicus и Ph. versicolor. И тринадцати подвидов фазана обыкновенного, обитающих на территории КНР – Ph. c. pallasi, Ph. c. sohokotensis, Ph. c. strauchi, Ph. c. edzinensis, Ph. c. kiangsuensis, Ph. c. torquatus, Ph. c. decollates, P. c. karpowi, P. c. shawii, P. c. elegans, P. c. mongolicus и P. c. suehschanensis. Филогенетические построения проводили с помощью пакета программ MEGA3, используя двухпараметрическую модель нуклеотидных замещений Кимуры, и разные методы кластеризации: невзвешенный парно групповой с арифметической средней (UPGMA), ближайшего соседа (Neighbor-Joining, NJ), минимальной эволюции (Minimum Evolution, ME) и максимальной парсимонии (МР). Устойчивость (статистическая значимость) филогенетических деревьев оценивали методом бутстрэпа (Felsenstein, 1985), используя 1000 реплик.

следующая страница >>