Клонирование - davaiknam.ru o_O
Главная
Поиск по ключевым словам:
страница 1
Похожие работы
Название работы Кол-во страниц Размер
Клонирование Термин "клон" 1 284.78kb.
Реферат на тему Клонирование 1 61.25kb.
Задача Клонирование гена gfp в бактериальный экспрессионный вектор... 1 194.66kb.
Стволовые клетки и клонирование 1 149.77kb.
Тема «Биотехнология, клеточная и генная инженерия, клонирование» 1 21.01kb.
Проблемный вопрос 2 426.78kb.
«Клонирование: «за» и 1 156.03kb.
Другая наука — открытия, которые от нас скрывают — Тайна зачатия... 11 1310.07kb.
Статья посвящена проблемам правовой охраны биотехнологических изобретений... 1 93.05kb.
Клонирование 1 274.59kb.
Закономерность? (Человек №3, 1998) Термин "клон" происходит от греческого... 1 242.62kb.
Клонирование 1 274.59kb.
Направления изучения представлений о справедливости 1 202.17kb.

Клонирование - страница №1/1




Клонирование

Введение.Проблема клонирования животных приобрела в последнее время нетолько научное, но и социальное звучание, поэтому оно широкоосвещается в СМИ, зачастую некомпетентными людьми и с непониманиемсути проблемы. В связи с этим возникает необходимость осветитьположение дела.Термин клон происходит от греческого слова «klon», что означаетветочка, побег, отпрыск. Клонированию можно давать много определений,вот некоторые самые распространенные из них, клонирование – популяцияклеток или организмов произошедших от общего предка путём бесполого размножения, причём потомок при этом генетически идентичен своемупредку.Воспроизводство организмов полностью повторяющих особь, возможнотолько в том случае, если генетическая информация матери будет безкаких-либо изменений передана дочерям. Но при естественном половомразмножении этому препятствует мейоз. В ходе этого незрелаяяйцеклетка, имеющая двойной, или диплоидный набор хромосом – носителейнаследственной информации – делиться дважды и в результате образуются четыре гаплоидных, с одинарным набором хромосом, клетки. Три из нихдегенерируют, а четвёртая с большим запасом питательных веществ,становится яйцеклеткой. У многих животных она в силу гаплоидностине может развиваться в новый организм. Для этого необходимооплодотворение. Организм, развившийся из оплодотворенной яйцеклетки,приобретает признаки, которые определяются взаимодействием материнскойи отцовской наследственности. Следовательно, при половом размножениимать не может быть повторена в потомстве.Как же вопреки этой строгой закономерности заставить клеткуразвиваться только с материнским диплоидным набором хромосом?Теоретически решение этой трудной биологической проблемы найдено. Растения.Клонирование, прежде всего, изначально относится к вегетативномуразмножению. Клонирование растений черенками, почками или клубнямиизвестно уже более 4 тысяч лет. Начиная с 70-х гг. нашегостолетия для клонирования растений стали широко использоватьнебольшие группы и даже соматические (неполовые) клетки.Дело в том, что у растений в отличие от животных по мере ихроста, в ходе клеточной специализации – дифференцировки – клетки нетеряют так называемые тотипотентные свойства, то есть, не теряютсвоей способности реализовывать всю генетическую информацию,заложенную в ядре. Поэтому практически любая растительная клетка,сохранившее в процессе дифференцировки своё ядро, может дать началоновому оргазму. Эта особенность растительных клеток лежит в основемногих методов генетики и селекции.При вегетативном размножении и при клонировании гены нераспределяются по потокам, как в случае полового размножения, асохраняются в полном составе в течение многих поколений.. Всёорганизмы, входящие в состав определённого клона имеют одинаковыйнабор генов и фенотипически не различаются между собой.Клетки животных, дифференцируясь, лишаются тотипотенстности, и в этом,одно из существенных отличий от клеток растений. Как будет показано ниже именно здесь главное препятствие для клонирования взрослыхпозвоночных животных. Клонирование шелкопряда.В изобретение клонирования животных, несомненно, надо отдать должное русским учёным. Сто лет тому назад русский зоолог московскогоуниверситета А.А. Тихомиров впервые открыл, что яички тутовогошелкопряда в результате различных химических и физическихвоздействий начинают развиваться без оплодотворения.Однако это развитие, названное партеногенезом, рано останавливалось:партеногенетические эмбрионы погибли ещё до вылупления личинок изяиц. Но это уже была прелюдия к клонированию животных.БЛ.Л. Астауров в 30-е гг. в результате длительных исследований,получивших мировую известность, подобрал термическое воздействие,которое одновременно активизировало неоплодотворённое яйцо к развитию и блокировало стадию мейоза, то есть превращение диплоидного ядраяйцеклетки в гаплоидное. Развитие с ядром, оставшимся диплоидным,заканчивалось вылуплением личинок, точно повторяющих генотип матери,включая и пол. Так, в результате амейотического партеногенеза былиполучены первые генетические копии, идентичные матери.Количество вылупившихся партеногенетических гусениц находилось взависимости от жизнеспособности матери.Поэтому у «чистых» пород былупление гусениц не превышало 1%, в товремя как у значительно более жизнеспособных межрасовых гибридовоно достигло 40-50%. Несмотря на огромный успех, автор этого методапережил горькое разочарование: партеногенетическое потомствохарактеризовалось пониженной жизнеспособностью на эмбриональных ипостэмбриональных стадиях развития (гусеницы, куколки, бабочки).Гусеницы развивались неравномерно, среди них было много уродливых, азавитые ими коконы различались по массе. Позже Астауров улучшилметод, применив гибридизацию между селекционными линиями. Так он смог повысить жизнеспособность у новых клонов до нормы, но довести доэтого уровня другие количественные признаки ему не удалось: например масса партеногенетических коконов не превышала 82% от массынормальных коконов такого же генотипа.Позднее установили причины партеногенетической депрессии и сложнымиметодами, которые позволили накапливать «гены партеногенеза», вывелиновые высоко жизнестойкие клоны самок, а позднее ипартеногенетических самцов. Скрещивая таких самцов со своими«матерями» или склонными к партеногенезу самками других клонов,получили потомство с ещё большей склонностью к партеногенезу. Отлучших в этом отношении самок закладывали новые клоны.В результате многолетнего отбора удалось накопить в генотипеселекционируемых клонов невиданно большое число генов, обуславливающих высокую склонность к партеногенезу. Вылупление гусениц достигло 90%,а их жизнеспособность повысилась до 95-100%, опередив в этомотношении обычные породы и гибриды. В дальнейшем «скрестили» спомощью партеногенетических самцов два генетически резко отличающихсяклона разных рас и от лучших гибридных самок вывелисверхжизнеспособные клоны.Наконец, научились клонировать самцов тутового шелкопряда. Это сталовозможным после того, как удалось получить самцов, у которых всепарные гены были идентичными, или гомозиготными. Вначале таких самцов клонировали особым мужским партеногенезом (андрогенезом). Для этоговоздействием гамма-лучей и высокой температуры лишали ядро яйцаспособности к оплодотворению. Ядро проникшего в такое яйцосперматозоида, не встретив дееспособного женского ядра, само,удваиваясь, приступало к развитию мужского зародыша, которыйестественно повторял генотип отца. Таким способом ведутся мужскиеклоны в десятках поколениях. Позже один из таких клонов былпреобразован в обоеполовую линию, также состоящих из генетическиидентичных (за исключением половых хромосом) теперь уже самок исамцов. Поскольку положивший начало этой линии полностью гомозиготный отец возник в результате размножения, приравненного ксамооплодотворению, то сам он и линия двойников обоего пола имеютпониженную жизнеспособность. Скрещивая между собой две такие линии,стали без труда получать гибридных и высоко жизнеспособныхдвойников в неограниченном количестве.Итоги клонирования шелкопряда: полученные клоны самок и самцовтутового шелкопряда для практического шелководства непригодны, но этоне крах всех надежд. Целесообразно использовать клоны не длянепостредственноо применения в шелководческой практике, а на племядля выдающегося по продуктивности потомства. Примерная схемаиспользования клонов в промышленном производстве выглядит следующимобразом. Из большого количества коконов выбирают те, из которыхразвиваются выдающиеся по продуктивности самки, и от каждой получают партеногенетическое потомство, для дальнейшей работы используютпартеногенетических клоны, которые повторяют высокую продуктивностьматери и проявляют высокую склонность к партеногенезу. За этимследует скрещивание с определёнными клонированными самцами и изполученного гибридного поколения выбирают два производства, только те клоны, которые дали прекрасное во всех отношениях потомство. Еговысокие качества обусловлены не только предшествующей селекцией, аещё и тем, что в процессе отбора особей на высокую склонность кпартеногенезу в их генотипе образуется комплекс геновжизнеспособности, компенсирующей вредное влияние искусственногоразмножения. При переводе клонов на половое размножение этоткомплекс, оказавшись несбалансированным, сильно повышает гетерозис. Первые опыты на амфибияхВозможность клонирования эмбрионов позвоночных впервые былапоказана в конце 40-х начале 50-х гг. в опытах на амфибиях, когда российский эмбриолог Георгий Викторович Лопашов разработал методпересадки (трансплантации) ядер в яйцеклетку лягушки. В июне 1948года он отправил в «Журнал общей биологии» статью, написанную поматериалам собственных экспериментов. Однако на беду Лопашова вавгусте 1948 года состоялась печально известная сессия ВАСХНИЛ,утвердившая по воле коммунистических вождей беспредельное господствов биологии малограмотного агронома Т.Д. Лысенко, и набор статьиЛопашова, принятой к печати, был рассыпан, потому что она доказывалаведущую роль ядра и содержащихся в нём хромосом в индивидуальномразвитии организмов. Работу Лопашова забыли, а в 50-х гг.американские эмбриологи Бриггс и Кинг выполнили сходные опыты, иприоритет достался им, как это часто случалось в истории российской науки.Бриггс и Кинг разработали микрохирургический метод пересадки ядерэмбриональных клеток с помощью тонкой стеклянной пипетки в лишённые ядра клетки (энуклеированные клетки).Они установили, что если брать ядра из клеток зародыша на раннейстадии его развития – бластуле (бластула – стадия в развитии зародыша,представляющая собой полный шар из одного слоя клеток), то примерно в 80% случаях зародыши благополучно развиваются дальше ипревращаются в нормального головастика. Если же развитие зародышейпродвинулось на следующую стадию – гастулу, то лишь менее чем в 20% случаев оперированные клетки развивались нормально. Эти результатыпозже были подтверждены в других работах.Большой вклад в эту область внёс английский биолог Гёрдон. Онпервый в опытах с южноафриканской жабой Xenopus laevis вкачестве донора ядер использовал не зародышевые клетки, а ужевполне специализировавшиеся клетки эпителия кишечника плавающегоголовастика. Ядра яйцеклеток-реципиентов он не удалял хирургическимпутём, а разрушал ультрафиолетовыми лучами. В большинстве случаевреконструированные яйцеклетки не развивались, но примерно десятаячасть из них образовывала эмбрионы, 5% из этих эмбрионов достигалыстадии бластулы, 2,5% стадии головастика и только 1% развивалось вполовозрелые особи (схема) однако появление нескольких взрослыхособей в таких условиях могло быть связано с тем, что среди клеток эпителия кишечника развивающегося головастика довольно длительноприсутствуют первичные половые клетки, ядра, которых могли бытьиспользованы для пересадки. В последующих работах, как самого автора,так и других исследователей не смогли подтвердить данные этихпервых опытов.Позже Гёрдон модифицировал эксперимент. Поскольку большинствореконструированных яйцеклеток с ядром клетки кишечного эпителияпогибают до завершения стадии гастулы, он попробовал извлечь из них ядра на стадии бластулы и снова пересадить их в новыеэнуклеированные яйцеклетки, такая процедура называется «серийнойпересадкой». Число зародышей с нормальным развитием после этогоувеличилось, и они развивались до более поздних стадий посравнению с зародышами, полученными в результате первичной пересадки ядер.Затем Гёрдон вместе с Ласки (1970 г од) стали культивировать invitro (вне организма в питательной среде) клетки почки, лёгкого икожи взрослых животных и использовать уже эти клетки в качестведоноров ядер. Примерно 25% первично реконструированных яйцеклетокразвивались до стадии бластулы. При серийных пересадках ониразвивались до стадии головастика. Таким образом, было показано, чтоклетки 3-х разных тканей взрослого позвоночного содержит ядра,которые могут обеспечить развитие по крайней может до стадииголовастика.В свою очередь ДиБерардино и Хофнер использовали для трансплантации ядра неделящихся и полностью дифференцированных клеток крови –эритроцитов лягушки Rana Pipiens. После серийной пересадки такихядер 10% реконструированных яйцеклеток достигали стадии плавающегоголовастика. Однако даже с помощью многократных серийных пересадок(более 100 клеточных циклов) реконструированные яйцеклетки дальшестадии головастика не развивались.Таким образом, во многих работах показано, что в случаи амфибийдонорами ядер могут стать лишь зародыши на ранних стадияхразвития.. Некоторые авторы называют подобные экспериментыклонированием амфибий, хотя правильнее их называть клонированиемэмбрионов амфибий, так как в этом случае размножают бесполым путёмне взрослых животных, а их зародышей.Дифференцировка клеток в ходе развития позвоночных сопровождаетсяинактиваций неработающих генов, поэтому клетки теряют тотипотентность,дифференцировка становится необратимой. В конце концов, у однихклеток происходит репрессирование генома, у других в той или инойстепени деградирует ДНК, а в некоторых случаях разрушается дажеядро. Однако на ряду с дифференцируемыми клетками, культивируемыми in vitro клеточные популяции содержат малодифференцируемые стволовыеклетки, которые и могут быть использованы как доноры ядер дляклонирования млекопитающих.Опыты с амфибиями показали, что ядра различных клеток одного итого же организма генетически идентичны и в процессе дифференцирвки постепенно теряют способность обеспечивать развитиереконструированных яйцеклеток, однако серийные пересадки ядер икультивирование клеток in vitro в какой-то степени увеличивают этуспособность. Неудачи экспериментов с мышами.Успешные опыты с амфибиями заставили задуматься учёных оклонировании млекопитающих, в частности мышей.МакКиннелл в одной из своих работах отмечал, что необходимые дляэтого методы уже существуют и непонятно почему мышь до сих порне клонирована.Однако предсказания МакКиннелла не сбылись, хотя в конце 70-х гг.опыты на мышах действительно начались и протекали весьмадраматично. К тому времени весьма основательно были изучены биология и генетика ранних этапов развития млекопитающих и в частностимыши как модельного объекта.Работа методически оказалась довольно трудной, прежде всего, потомучто объём яйцеклетки у млекопитающих примерно в тысячу раз меньше,чем у амфибий. Однако эти трудности были успешно преодолены.Экспериментаторы научились успешно микрохирургическим путём удалятьпронуклеусы (одно из двух гаплоидных ядер в яйце млекопитающих, впериод после проникновения сперматозоида, но до слияния женского имужского пронуклеусов в ядро зиготы в процессе оплодотворения.Мужское ядро формируется из ядерного материала сперматозоида, женское из хромосом яйцеклетки) из зигот мыши и пересаживать в нихклеточные ядра ранних эмбрионов. Однако все полученные разнымспособом зародыши мышей развивались лишь до стадии бластулы.В 1977 году появилось сенсационное сообщение Хоппе и Илменсе отом, что они получили 7 взрослых самок мышей, пять из которыхимели только материнский, а две отцовский геном. Это, якобы, зависелоот того, какой пронуклеус был оставлен в яйце – женский илимужской, он и определял особи по типу гиногенеза или андрогенеза(гиногенез – развитие яйца без участия сперматозоида, андрогенез –развитие яйца, имеющие только отцовские хромосомы – мужскойпартеногенез). Их успех был связан, по описанию авторов, с тем, что,удаляя один пронуклеус, они удваивали число хромосом другого,обрабатывая яйца специальным веществом, затем выращивали полученныедиплоидные гомозиготные зародыши in vitro до стадии бластулы ипересаживали в матку самки-реципиента для дальнейшего развития.Казалось, теперь можно будет быстро получить млекопитающих со 100%гомозиготностью по всем признакам. Это особенно важно для селекции,так как для получения сельскохозяйственных животных, в частностикрупного рогатого скота с закреплёнными особо ценными качествамиобычными приёмами требуются десятки лет работы.Однако данные Хоппе и Илменси подтвердить не удалось, хотя многиепытались это сделать. Оказалось, что полученные любым способомдиплоидные андрогенетические и гиногенетические зародыши мышейпогибают, а тех же стадиях, что и диплоидные партеногенетические(развивающиеся из неоплодотворённой яйцеклетки) эмбрионы.Значительно усовершенствовав методы извлечения ядер и введения их в клетку, МакГрат и Солтер провели свою серию экспериментов исообщили, что высокий выход живых мышей они получили, когда вкачестве доноров ядер они использовали зиготы, но если донорамибыли ранние эмбрионы, то реконструированные яйцеклетки, как ипрежде, развивались только до стадии бластулы.Метод МакГрата - Солтера стал широко использоваться разнымиэкспериментаторами. Так Манн и Ловел-Банж выделяли пронуклеусы яиц,активированных к партеногенезу, и пересаживал их в энуклеированныезиготы мышей. В этих случаях эмбрионы погибали на ранних стадиях.Если же, наоборот, пронуклеусы получали из оплодотворённых яиц ипересаживали в партеногенетические и лишённые ядра яйца, то такиезародыши развивались нормально до рождения.Сурани с соавторами установили, что если добавить женские пронуклеус из зиготы мыши к гаплоидному набору хромосом яйцеклетки, тонормального развития не происходит, добавление же мужского ядраприводит к нормальному развитию. С другой стороны, рекомбинацияженского и мужского пронуклеусов из ранних оплодотворённыхяйцеклеток мышей обеспечивает нормальное развитие, а комбинация 2-хмужских или 2-х женских пронуклеусов останавливает развитие эмбриона.Эти опыты показали, что для нормального развития млекопитающихтребуется два набора хромосом – отцовский и материнский. Поэтому ниу одного из известного вида млекопитающих не описан партеногенез.Поэтому же работы Хоппе и Илменсе не удалось повторить.Однако такие исследование ещё дважды будоражили научное сообщество.В 1982 году пересадили ядра клеток партеногенетических бластулмышей в энуклеированные зиготы. Некоторые из этих реконструированных яйцеклеток нормально развивались, и якобы получены четыре взрослыхсамки, но в свете вышесказанного эти результаты маловероятны.Гибель партеногенетических (гиногенетических и андрогенетических)зародышей у млекопитающих связана с различной активацией онтогенезаматеринского и отцовских геномов. Механизм, регулирующий этифункциональные различия, был назван геномным импритингом и изучалсяв ряде работ, где было показано, что для нормального развитиямлекопитающих требуется наличие мужского генома.Другая статья Илменсе и Хоппе имела ещё больший резонанс. Авторысообщили о пересадки ядер внутренней клеточной массы бластулы вэнуклеированные зиготы мышей и получения трёх взрослых особей (двух самок и одного самца), генетически идентичной донорской линиимышей. Введение ядер-доноров и удаление пронуклеусов из зиготыпроводили за один приём, затем реконструированные яйцеклеткикультивировали in vitro до стадии бластулы и пересаживали в маткусамок. Из 16 пересаженных бластул три развились во взрослые особи.В следующей работе эти же авторы использовали в качестве доноров-ядер клетки эмбрионов ещё более поздней стадии (семь суток) ибудто бы получили трёх половозрелых мышей. Однако никто изработающих в том же направлении не смог добиться подобныхрезультатов, и достоверность результатов Илменсе и Хоппе вновь былапоставлена под сомнение.МакГрат и Солтер показали, что ядра 8-клеточных зародышей и клетоквнутренней клеточной массы бластулы не обеспечивают развития invitro реконструированных яйцеклеток даже до стадии морулы, котораяпредшествует стадии бластулы. Наибольшая часть (5%) 4-клеточныхзародышей даёт возможность развиваться только до стадии морулы. Втоже время 19% реконструированных яйцеклеток 2-ядерных клеточныхзародышей, смогли спокойно достичь стадии морулы или бластулы.Эти и другие данные показывают, что в эмбриогенезе у мышейклеточное ядро рано теряет тотипотентность, что связано, очевидно, сочень ранней активизацией генома зародыша – уже на стадиях двухклеток. У других млекопитающих, в частности у кроликов, овец икрупного рогатого скота, активизация первой группы генов вэмбриогенезе происходит позднее, на 8-16 клеточной стадии. Возможно,поэтому первые значительные успехи в клонировании животных былидостигнуты на других видах млекопитающих, а не на мышах.Тем не менее, особый интерес вызывают опыты группы учёных изуниверситета в Гонолулу во главе с Риузо Янагимачи. Авторам удалось усовершенствовать метод Уилмута, о котором речь пойдёт ниже, ониотказались от электрической стимуляции слияния донорской соматической клетки с яйцеклеткой и изобрели такую микропипетку, с помощьюкоторой можно было бы безболезненно извлекать ядро из соматическойклетки и трансплантировать его в обезъядренную клетку. Кроме того,авторы использовали в качестве донорских относительно менеедифференцированные ядра клеток, окружающих ооцит. Наконец, удалось,как бы синхронизировать процессы, протекающие в яйцеклетке итрансплантируемом в нём ядре, что позволило обеспечить естественныеядерно-цитолазматические взаимоотношения между ядром и цитоплазмой,поскольку трансплантируемое дифференцированное в определённомнаправлении ядро и цитоплазма яйцеклетки до того работали как быв разных режимах.Авторы использовали для трансплантации ядра клеток, окружающих ооцит(клеток так называемого cumulus oophorus), клеток Сертоли изсеменников и клеток, выделенных из мозга. Ядра, выделенные изсоматических клеток, инъецировали в энуклеированное яйцо с помощьюмикропипетки. Яйцо активировали к развитию, поместив в специальныйраствор (так называемый HEPES-CZB), свободный от кальция, и добавляястронций и цитохалазин.Стронций активировал яйцо, а кальций подавлялобразование полярных телец. Эмбрионов культивировали до стадии 2-8клеток, морулы или бластулы, а затем трансплантировали в маткуприёмной матери, где многие из них имплантировались и некоторые из них (15-16%) продолжали своё развитие. Процент выхода рождённыхмышат (их извлекали с помощью кесарева сечения на 18, 5-19-й днибеременности) был, однако, низок – в разных сериях экспериментов от 2 до 2,8%. Молекулярные исследования доказали принадлежность ядеррождённых мышат к клеткам донора соматических клеток.Таким образом,по крайней мере в некоторых случаях доказана способность ядерсоматических клеток обеспечивать нормальное развитие млекопитающих. Тем не менее, работы с мышами, несмотря на их непростую судьбу,значительно расширили наши представления о методологии млекопитающих. Кролики и коровы.Американские исследователи Стик и Робл, используя метод Солтера иМакГрата, получили шесть живых кроликов, пересадив ядра 8-клеточныхэмбрионов одной породы в лишённые ядра яйцеклетки кроликов другойпороды. Фенотип родившихся полностью соответствовал фенотипу донора.Однако только 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%)развились в нормальных животных. Это, конечно, очень низкий выход,практически не позволяющий рассчитывать на получение таким способомклона генетически идентичных животных. Ценность этой работы, тем неменее, в том, что она показала возможность клонирования эмбрионовкроликов.Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных,коров или овец, идёт несколько по-другому. Их сначала культивируютне in vitro, а in vivo – в перевязанном яйцеводе овцы –промежуточного (первого) реципиента. Затем их оттуда вымывают итрансплантируют в матку окончательного (второго) реципиента – коровыили овцы соответственно, где их развитие происходит до развитогодетёныша. Уиландсин предложил заключить реконструированные яйцеклеткив агаровый цилиндр, который он потом трансплантировал в перевязанный яйцевод овцы или коровы. По данным одних авторов реконструированныезародыши лучше развиваются в яйцеводе, чем в культивированной среде,хотя некоторые исследователи получили неплохие результаты и прикультивировании in vitro.Американцы Робл и его сотрудники использовали щадящий методизвлечения ядра без прокалывания мембраны яйцеклетки, предложенныеМакГратом и Солтером, пересаживали в зиготы так называемыекариопласты – мужской и женский пронуклеусы вместе с окружающей ихцитоплазмой, а также ядра 2-, 4- или 8-клеточных эмбрионов коровы.Сначала пронуклеусы центрифигурировали, чтобы освободить пронуклеусыот окружающих их гранул желтка, после чего ядра были хорошо видныпод микроскопом, что значительно облегчало их удаление. При помощиманипулятора и заострённой стеклянной пипетки извлекали один избластомеров вместе с ядром из ранних зародышей и переносили его в энуклеированную зиготыРеконструированные зародыши были заключены в агаровый цилиндр ипересажены в перевязанный яйцевод овцы. Через пять днейкультивирования их вымывали, освобождали от агара и исследовали.Реконструированные зародыши в этом случае развивались только в техслучаях, где зиготы в зиготы пересаживали пронуклеусы: 17% такихзародышей достигли стадии морулы или бластулы. Два зародыша былипересажены второму реципиенту – в матку коровы и развитие ихзавершилось рождением живых телят. Если в качестве доноровиспользовали ядра 2-, 4- и 8-клеточных зародышей, тореконструированные яйцеклетки не развивались даже до стадии морулыПозже были и более успешные работы. Уиландсин, в частности, сообщил,что ему удалось получить четырёх генетически идентичных бычковхолстейской породы в результате пересадки в реципиентные яйцеклеткиядер бластул одного 32-клеточного зародыша. Автор утверждал, чтобольшинство ядер сохраняют тотипотентность на 32-клеточной стадии, азначительная их часть 64-клеточной стадии, обеспечивая нормальноеразвитие реконструированных яйцеклеток до стадии морулы в яйцеводе.После пересадки в матку коров – окончательных реципиентов. Какполагает автор, они могут и дальше нормально развиваться.Бондиоли и соавторы, используя в качестве доноров ядер 16-64-клеточные зародыши коров, трансплантировали 463 реконструированных зародыша вматку синхронизированных реципиентов, и было получено 92 живыхтелёнка. Семь из них были генетически идентичны, представляя собойклон, полученный в результате пересадки ядер клеток одногодонорского эмбриона.Таким образом, клеточные ядра зародышей крупного рогатого скотадостаточно долго сохраняют тотипотентность и могут обеспечить полное развитие реконструированных яйцеклеток. Иначе говоря, методическиетрудности клонирования зародышей крупного рогатого скота практическирешены. Но остаётся основная задача – найти донорские ядра, обладающие тотипотентностью, для клонирования взрослых животных. Клонирование овец.Уиландсин ещё в 1986 году показал, что эмбрионы овец на 16-клетоной стадии развития сохраняют свою тотипотентность.Реконструированные яйцеклетки, содержащие ядра бластомеров 16-клетоныхзародышей, развивались нормально до стадии бластулы в перевязанномяйцеводе овцы (в агаровом цилиндре), а после освобождения от агара,пересаживали в матку овцы – второго реципиента – ещё на 60 дней. Вдругом случае донорами служили ядра 8-клетоных зародышей и былиполучены три живых ягнёнка, фенотип которых соответствовал породеовцы-донора.В 1989 году Смит и Уилмут трансплантировали ядра клеток 16-клетосного эмбриона и ранней бластулы в лишённые ядранеоплодотворенной яйцеклетки овец. В первом случае было получено два живых ягнёнка, фенотип которых соответствовал породе овец – доноровядер.Во втором случае один полностью сформировавшийся ягнёнок погибво время родов. Его фенотип также соответствовал породе-донору.Авторы считали, что в ходе дифференцировки эмбрионных клетокпроисходит инактивация некоторых важных для развития генов и врезультате ядра бластулы уже не могут репрограммироваться вцитоплазме яйцеклетки и обеспечить нормальное развитиереконструированного зародыша. Поэтому, по мнению авторов, в качестведоноров ядер лучше использовать 16-клеточные эмбрионы иликультивированные in vitro линии эмбриональных клеток, ядра которыхобладают тотипотентностью.Позднее, в 1993-95 гг., группа исследователей под руководствомУилмута получила клон овец – пять идентичных животных, донорами ядеркоторых была культура эмбриональных клеток. Клеточную культуруполучали следующим образом: выделяли микрохирургическим путёмэмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона (бластулы) икультивировали клетки in vitro в течение многих пассажей (покрайней мере, до 25). Сначала клеточная культура напоминала культуру стволовых дифференцированных эмбриональных клеток, но вскоре, после 2-3 пассажей, клетки становились уплотнёнными и морфологически сходными с эпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного зародыша овцыбыла обозначена как TNT4.Чтобы донорское ядро и реципиентная цитоплазма находилась насходных стадиях клеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4 на определённой стадии (GO) и ядра этих клетокпересаживали в энуклеированные яйцеклетки (соответственно на стадииметафазы II). Реконструированные эмбрионы заключали в агар итрансплантировали в перевязанные яйцеводы овец. Через шесть днейэмбрионы вымывали из яйцеводов промежуточных реципиентов иисследовали под микроскопом. Отбирали те, которые достигали стадииморулы и бластулы и пересаживали их в матку овцы – окончательногореципиента, где развитие продолжалось до рождения. Родилось пятьягнят (самок), из них две погибли вскоре после рождения, третья ввозрасте десяти дней, а две оставшихся нормально развивались идостигли 8-9-месячного возраста. Фенотипически все ягнята были сходны с породой овец, от которой получали исходную линию клеток TNT4.Это подтвердил и генетический анализ.Эта работа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, -значительное достижение в клонировании млекопитающих, хотя она и невызвала особого интереса, как статья того же Уилмута с соавторами,опубликованная в 1997 году, где сообщалось, что в результатеиспользования донорского ядра клетки молочной железы овцы былополучено клональное животное – овца по кличке Долли. Последняя работа методически во многом повторяла предыдущие исследования 1996 года,но в ней учёные использовали не только эмбриональные, но ещё ифибробластоподобные клетки (фибропласты – клетки соединительной ткани)плода и клетки молочной железы взрослой овцы. Клетки молочной железы получали от 6-летней овцы породы Финн Дорсет, находящейся напоследнем триместре беременности. Все три типа клеточных культуримели одинаковое число хромосом – 54, как обычно у овец.Эмбриональные клетки использовали в качестве доноров ядер на 7-9пассажах культивирования, фибробластоподобные клетки плода на 4-6пассажах и клетки молочной железы на 3-6 пассажах. Деление клетоквсех трёх типов оставливали на стадии GO и ядра клетокпересаживали в энуклеированные ооциты (яйцеклетки) на стадииметафазы II. Большинство реконструированных эмбрионов сначалакультивировали в перевязанном яйцеводе овцы, но некоторые эмбрионыкультивировали in vitro в химически определённой среде. Коэффициентвыхода морул и бластул при культивировании in vitro в одной серии опытов был даже вдвое выше, чем при культивировании в яйцеводе(поэтому видимо нет строгой необходимости в промежуточном реципиенте и можно обойтись культивированием in vitro).Выход морул и бластул в серии опытов с культурой клеток молочнойжелезы, был примерно втрое меньше, чем в двух других сериях, когдав качестве доноров ядер использовали фибропластов плода илиэмбриональных клеток. Число живых ягнят в сравнении с числомпересаженных в матку окончательного реципиента морул или бластулбыло также в два раза ниже. В серии опытов с клетками молочнойжелезы и 277 реконструированных яйцеклеток был получен только один живой ягнёнок, что говорит об очень низкой результативности такогорода экспериментов (0,36%). Анализ генетических маркеров всех семиродившихся в трёх сериях экспериментов живых ягнят показал, чтоклетки молочной железы были донорами ядер для одного, фибропластыплода – для двух и эмбриональные клетки четырёх ягнят.. Овца Доллиразвилась из реконструированной яйцеклетки, донором ядра которой была культивируемая клетка молочной железы овцы породы Финн Дорсет.Долли фенотипически не отличается от овец этой породы, но сильноотличается от овцы-реципиента породы шотландская черномордая. Анализгенетических маркеров подтвердил этот результат.Успех авторов этой работы, прежде всего, связан с использованиемдлительных клеточных культур, так как после многих пассажей вкультуре клеток могли быть отобраны малодифференцированные стволовыеклетки, которые вероятно и были использованы как доноры ядер.Большое значение имел также тот факт, что авторы, учитываярезультат своих прошлых работ, синхронизировали стадии клеточногоцикла яйцеклеток реципиента и яйцеклеток донора.Своей работой Уилмут с коллегами продемонстрировали, что ядра клеток молочной железы взрослой овцы могут быть при определённых условиях репрограммированы цитоплазмой ооцита и дать развитие новомуорганизму. Полученные данные заставили по-новому посмотреть напроцесс клеточной дифференцировки. Этот процесс, как оказалось, неносит необратимый характер. Совершенно ясно, что цитоплазматическиефакторы способны инициировать развитие нового организма на основегенетического материала ядра взрослой полностью дифференцированнойклетки. Таким образом, биологические часы могут быть повёрнутывспять, и развитие организма может начаться из генетическогоматериала взрослой дифференцированной клетки, что полностьюпротиворечить раннее общепринятой биологической догме.Если результаты последней работы Уилмута и соавторов окончательноподтвердятся и будет повышен коэффициент выхода живых животных прииспользовании в качестве доноров ядер клеток взрослых животных, тоэто может иметь революционное значение как в биотехнологии животных и животноводстве. Клонирование позволит сохранить не только генотипценных и выдающихся в производственном отношении животных, но ибезгранично размножать их. Тканевое клонирование.Учёные хотят создавать человеческие эмбрионы в лабораториях ииспользовать их для получения специальных клеток, которые могутприменяться в революционных методиках лечения. Правда клонирование не очень-то подходит для названия этой операции, так как вызываетнепонимание у людей, что же на самом деле происходит? Учёные некопируют эмбрионы, они берут генетический материал из клетки телавзрослого человека и пересаживают его в яйцеклетку, из которойудалён генетический материал.При соблюдении определённых условий эта новая яйцеклетка можетразвиваться в эмбрион. Эта та самая технология, которая былаиспользована для создания овечки Долли.Почему учёные так интересуются этой технологией? Это даётвозможность получить так называемые стволовые клетки различныхтканей, абсолютно идентичных клеткам человека, у которого был взятгенетический материал. Например, учёные могут получить нервную ткань,кровь, сердечную мышцу и даже белое и серое вещество мозга.Учёные пытались выделить стволовые клетки определённых тканей напротяжении многих лет, когда, наконец, это удалось в 1998 году.Учёные утверждают, что стволовые клетки могут обеспечить медиковполностью совместимой трансплантационной тканью. Первоначальнопланируется имплантировать клетки в организм для восстановлениядефектов тканей, вызванных болезнью, например, восстановление сердечноймышцы после инфаркта. В будущем планируется добиться возможностивыращивать из стволовых клеток полностью работоспособные ткани.Почему клонирование является неотъемлемой частью этого? Клонированиетак важно, потому что позволяет создать ткани и органы с полностью идентичным генетическим кодом. В настоящее время главная проблематрансплантологии – отторжение пересаженных органов и тканей из-заиммунного конфликта. Медики используют для его решения мощныеиммунодепрессивные препараты, которые обладают большим количествомпобочных эффектов. Клонирование полностью решает эту проблему – клетки имплантанты имеют то же генотип и иммунная система признаёт ихза свои родные. Это снимает проблему поиска генетически подходящихдоноров, например, при пересадки костного мозга. Используя ДНК, взятоеиз клеток кожи, учёные могут создать клетки костного мозга.При помощи тканевого клонирования можно лечить любые болезни,вызывающие дегеративные изменения тканей. Новая нервная ткань можетпомочь при болезни Альцгеймера, новая сердечная ткань при инфаркте.Правда против тканевого клонирования есть много противников. Многиедумают, что эмбрион, даже если это одна клетка, представляет собойполноценную человеческую жизнь и уничтожение его или опыты над ним равны действиям над взрослым человеком. Заключение.Итак, работы по клонированию позвоночных были начаты на амфибиях вконце 40-х начале 50-х гг. и продолжаются вот уже более 4-хдесятилетий. Что касается амфибий, то, как было сказано всоответствующем разделе, несмотря на значительные достижение, проблемаклонирования взрослых особей остаётся до сих пор нерешённой.Установлено, что в ходе клеточной дифференцировки у позвоночныхпроисходит либо потеря определённых генных локусов либо ихнеобратимая инактивация. Судя по всему, утрачивается та часть генома,которая контролирует не ранние, а более поздние стадии онтогенеза, в частности метаморфоз амфибий. Механизм этого явления не поддаётсяпока научному объяснению. Но очевидно, что для клонирования взрослыхживотных необходимо использовать малодифференцируемые делящиесяклетки.Ещё 5-6 лет назад никто их учёных не ставил вопрос обиспользовании в качестве доноров ядер клеток взрослых млекопитающих.Работы сводились в основном к клонированию эмбрионов домашнихживотных, и многих из этих исследований были не очень успешны.Поэтому так поразило появившиеся на свет в начале 1997 годасообщение Уилмута, что ему и его коллективу удалось, используясоматические клетки взрослых животных, получит клональное животноеовцу по имени Долли.Каково же положение вещей сейчас? Есть ли серьёзные основаниясчитать, что реально наступила эра клонирования млекопитающих? Анализпредставленных выше данных показывает, что за последние десять летв результате кропотливой работы многих исследователей, действительносделан прорыв в области клонирования эмбрионов млекопитающих. Что же касается взрослых животных, то пока в наличии лишь один пример,хотя Долли, без сомнения, уже вошла в историю науки.Но у этого первого успешного эксперимента есть существенныйнедостаток – очень низкий коэффициент выхода живых особей (0,36%) иесли учесть высокий процент гибели развивающихся реконструированныхяйцеклеток в плодный период развития (62%), который в десять развыше, чем в обычном скрещивании (6%), то встаёт вопрос о причинахгибели зародышей.В ближайшие годы главная задача исследователей, работающих в области исследования клонирования – это, по-видимому, создание культивируемыхin vitro линий малодифференцированных клеток, характеризующихсявысокой скоростью деления. Ядра именно таких клеток должныобеспечить полное и нормальное развитие реконструированныхяйцеклеток, формирование не только морфологических признаков, но инормальных функциональных характеристик клонированного оргинизма.Что же касается вопроса о клонировании человека, то в обсужденииэтого вопроса следует выделить два аспекта: методический иэтический.Методически или технически клонирование взрослых млекопитающихразработано ещё недостаточно, чтобы можно было уже сейчас ставитьвопрос о клонировании человека. Для этого необходимо расширить кругисследований, включив в него кроме овец представителей и другихвидов животных. Уилмут с сотрудниками планируют, например, продолжитьсвои работы на коровах и свиньях. Такие работы необходимы, чтобыустановить, не ограничивается ли возможность клонирования взрослыхмлекопитающих особенностями или спецификой какого-либо одного илинескольких видов.Затем необходимо существенно повысить выход жизнеспособныхреконструированных эмбрионов и взрослых клонированных животных,выяснив не влияют ли методические приёмы на продолжительность жизни, функциональные характеричтики и плодовитость животных. Дляклонирования животных очень важно снизить риск дефективного развития реконструированной яйцеклетки, главной причиной которого может бытьнеполное репрограммирование генома донорского ядра.Кстати, в природе всё-таки имеются случаи клонирования человека, этооднояйцовые или монозиготные близнецы – настоящие клоны с одним итем же геномом, возникающие при разделении одной зиготы на раннейстадии развития. Это всегда только оба мальчика или обе девочки ивсегда удивительно похожие друг на друга. Известно также, чтоэмбрион млекопитающего, в том числе и человека на самых раннихстадиях развития, у человека по крайней мере до стадии 8бластомеров, может быть без видимых отрицательных последствийразделён на отдельные бластомеры, из которых при определённыхусловиях могут развиться идентичные по своему генотипу особи, поанологии с однояйовыми близнецами,то есть из одного 8-клеточногоэмбриона могут родиться 8 мальчиков или девочек абсолютноидентичных.Что касается этической стороны, то тут клонирование человекавызывает ещё больше возражений. Во-первых, становление человека какличности базируется не только на биологической наследственности, оноопределяется также семейной, социальной и культурной средой. Приклонировании индивида невозможно воссоздать все те условиявоспитания и обучения, которые сформировали личность его прототипа.Во-вторых, при бесполом размножении изначально жёсткаязапрограмированность генома предопределяет меньшее разнообразиевзаимодействия организма с окружающими изменчивыми условиями среды. В-третьих, практически все религиозные учения настаивают на появлениичеловека на всет – в “руках” высших сил, что зачатие и рождениедолжны происходить естественным путём.В итоге говорить о клонировании человека мы можем говорить лишь ссугубо теоритической точки зрения. В сущности речь идёт даже не оклонировании, а о получении копии отдельного индивида, посколькутермин клонирование предполагает получение некоего множества особей.Очевидно, что сегодня вероятность отрицательных последствий этойпроцедуры значительно превышает её выгоды, поэтому работы поклонированию человека как в настоящее время, так и в ближайщёмбудущем проводить нецелесообразно, так как переносить ещё нерешённуюметодически научную работу на опыты с человеком безнравственно.Поэтому Федерация научных экспериментальных обществ биологов США воктябре 1997 года объявила пятилетний мораторий на эксперименты поклонированию человека.Когда же услвершенствуется метод клонирования и мы сможемклонировать человека, то проблема клонирования должна будетрегламентироваться строгими рамками и правилами, касаясь возможнотолько медицинских проблем, скажем непреодолимого бесплодия. Определения.Клон – совокупность клеток или организмов, генетически идентичныходной родоначальной клетке.Клонирование – получение идентичных потомков при помощи беспологоразмножения, процесс изготовления генетически идентичных копийотдельной клетки и организма.Тотипотентность – свойство клетки реализовывать генетическую информацию ядра, обеспечивающего развитие до целостного организма. Тотипотентнаяклетка способна дифференцироваться в любую ткань илиспециализированную клетку.Партеногенез – развитие зародыша из неоплодотворённой клетки,девственное размножение.Гиногенез – развитие яйца без участия сперматозоида – женскийпартеногенез.Андрогенез – развитие яйца, имеющего только отцовские хромосомы –мужской партеногенез.Энуклеация – методы, включающие полное удаление ядерного материала изяйцеклетки.Бластомеры – клетки, образующиеся при дроблении яйца животных.Морула – стадия в развитии зародыша, на этой стадии зародышнапоминает по внешнему виду малину, без особой обособленной полости.Бластула – стадия в развитии зародыша, представляющая собой полныйшар из одного слоя клеток, эта стадия завершает процесс дробленияяйца. На стадии бластулы внутри зародыша образуется полость –бластоцель.Гаструла – стадия в развитии зародыша, на этой стадии зародышхарактеризуется наличием двухслойной стенки и полости (гастроцеля),сообщающейся с внешней средой отверстием – бластопором. Список литературы.Соровский образовательный журнал, 1999 №4, клонирование животных,Л.И.Корочкин.Журнал «Человек», 1998 №3, Долли – случайность или закономерность?Конюхов Б.В.Журнал «Свет: природа и человек», 1999 №1.Журнал «Студенческий меридиан», 2001 январь.Журнал «Природа», 1998 №7, клонирование животных: теория и практикаСтрунников В.А.Ресурсы всемирной компьютерной сети Internet.




Они хотят быть гражданами космоса, и клеймят позором космополитизм. Станислав Ежи Лец
ещё >>